在实际工作中，在金溶胶中加入蛋白质后，会由于静电、疏水和范德华力相互作用而引发其在金颗粒表面的自发吸附，这是胶体金标记得以进行的基础。离开这个基础，胶体金标记是没办法进行的。

为了制备金颗粒标记的蛋白质，通常先将将金悬浮液搅拌混匀（你肯定遇到过这种情况：如果颗粒比较大，放置一段时间会出现颗粒下沉，注意此处不是金颗粒形态发生变化导致的聚沉！而只是因为重力作用引起的正常金颗粒在溶液中的非均匀分布。因此标记时候需要混匀后使用），同时加入大量的蛋白质。当金颗粒与蛋白质分子结合时，随着金颗粒变得稳定和裸金颗粒的减少，特征波长处的吸光度通常会下降。为了检查吸附过程的完整性，并确定金颗粒是否完全被饱和标记，我们可以取一部分液体，并加入少量氯化钠溶液。如果在加入氯化钠后发生聚沉，则说明金颗粒还有没被蛋白吸附存在比较多的裸金颗粒，应该添加更多的蛋白质来进一步吸附裸金颗粒。最后，通常会添加聚乙二醇（PEG）或免疫反应阻断剂，如BSA或脱脂奶粉溶液，来进一步稳定蛋白质结合后的胶体悬液。这些封闭蛋白基本会完全占据绝大分部分潜在的金-金复合物或金-蛋白复合物相互作用的剩余位点，从而防止了在存储、检测过程中的聚集或非特异性结合。

关于待标记蛋白用量，大部分研发人员通常的做法是：先确定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白质所需量，在此基础上增加约10-20%的过量蛋白（霍里斯伯格和罗塞特，1977；De Mey等人，1981）。但这个确定蛋白具体用量多少的工作其实针对大部分项目或者新手研发人员来说，已经没有太多必要去动手再确定到底多少蛋白才是最少量，除非是项目蛋白成本很高，你可以去做个试验往下走走好好降降成本。胶体金技术这么多年下来，N多的被后浪拍在沙滩上且已经被晒得嘎嘣脆的研发前辈早已经留下了适合绝大部分项目标记的蛋白使用量。通常来说10ug/ml的用量已经绝对能让你的蛋白丰度够到姥姥家了，笔者甚至试过3ug/ml的用量姥姥家都表示够用了。但是需要注意的是，如果你使用的金溶液浓度比较高的话，还是需要相应按照适当的比例提高蛋白的使用量，否则姥姥就有可能告诉你蛋白用量有点点不那么给力了。

总体来说，为了获得比较理想的标记物之外，在用金颗粒标记蛋白质时，需要考虑几个参数：

(1)蛋白质的pI，

(2)吸附过程的pH，

(3)标记反应中的蛋白质的量。

一般认为，大多数蛋白质可以在其等电点或附近最大限度地和胶体金颗粒进行吸附（Norde，1986）。但是就pH这个参数，在金标记过程中再怎么强调也不为过，甚至可以说“成也pH，败也pH”.这个参数对凭金标记这个技能混江湖的人来说绝对算得上是内家真气般的存在。没有一定程度的修炼是不好去江湖随便飘的。甚至有些待标记蛋白的纯度、性能决定了标记过程pH会出现和常规做法特别不一样的要求，先举例说明如下：

A、对于许多蛋白质，特别是抗血清来源的免疫球蛋白，平均pI是一个包含一系列pH值的范围。因此，多克隆抗体制备可能具有与特定纯化的单克隆抗体非常不同的平均pI。这一点相信广大金标研发人员是有所体会的，通常就是多抗比较好标记，但是活性不尽如人意，单抗虽然没多抗好标，但标记出来后效果喜人。原因就在于此。

B、另外一点，个别蛋白对pH非常挑剔，当你用第一步调整好pH的金溶液中加入蛋白后，一切反应都很和谐、美好，反应的页面也很丝滑，但当你第二次加入封闭蛋白后满怀希望的等待收货美好的标记物时，诡异、惨烈的画面通常会出来把你英俊潇洒的脸摁花岗岩地面上摩擦一顿：你会发现溶液会慢慢的、逐渐的变成蓝色、或者紫色，甚至会有沉淀析出，人品差的他最后直接会给你变成一汪清水！咦，他怎么就变色儿呢？他怎么能变色了呢！问题是，你这一变色儿，你让你旁边新招来的实验助手小妹妹对你那崇拜的眼神往何处安放？！是啊，他怎么就变色儿了呢？其实，这个问题主要是就是待带标记蛋白对pH非常敏感造成的，加入封闭蛋白后改变了溶液pH所致，需要你在加入封闭蛋白过程中持续稳定溶液的pH才能让标记过程进行下去。

就算你确定好了标记pH，咱们通常会加入碳酸钾到金溶液里边去，然后再搅拌。但是，我告诉你，你如果对你的pH计下手够狠的话，你可以用探头直接伸入到你的金溶液里边，然后睁大眼睛瞅个faiwu分钟，我保证你会看见一个魔幻的情况出现：你调整好的金溶液的pH它就像遥远星空的星光一样一闪一闪的在你眼前欻欻跳动并且一直往下降。通常faiwu分钟估计至少能给你掉个0.5个pH！厉害吧，刺激吧？是不是又听到了你那英俊的脸和花岗岩摩擦的呲呲声！开始我遇到这种情况就傻眼了，心想：这啥情况哇！那啥、实验前我特意用清水洗手了三遍呐！看见小偷偷东西我也喊了呀！公交车上我也给老奶奶让座了哇，过斑马线我也没闯红灯撒。卧槽，肯定是过马路的时候走在我身边的老奶奶我没扶她！其实不是我不想扶她，是她走路速度比我快！等你在心里对心灵彻底来一次涤荡后，我们来处理这个问题，原则就是：多次平衡，尽快结合。多次平衡控制pH的下降幅度，尽快结合缩短波动时间。

虽然我们说蛋白质与金颗粒的标记没有普遍一致的标准，但可以通过遵循下面这些一般准则来提高标记过程的效率：

(1)在pH的pI范围内或略高于pI；但在实际中往往这个策略效果一般，真的勇者往往出其不意而获得意外之喜。期待你也一样！大胆往往能让你成为整个实验室最靓的仔！

(2)向金颗粒注入的蛋白质量比氯化钠破坏实验时略高（约10%）；

(3)避免蛋白质的高饱和，因为这可能会促进结合材料的浸出；这点真的可以采纳，10ug/ml用量绝对姥姥家够了，甚至舅舅家也都够了。省时间可以直接用这个量，省出宝贵时间给实验助手培训下理论和实验注意事项的细节它不香吗？

(4)通过测定溶液在特征波长处的吸光度来评价金颗粒的吸附程度和聚沉程度；

(5)优化每个蛋白质-金颗粒偶联物，来确定胶体的稳定性和活性。优化工作是个细活，需要花时间和精力去做、熬，这是也绝大部分小白菜成长为大神的最好的路、其实也是最好的捷径。这个工作相当于在对标记工作做PDCA持续改进，同时、他对你获取、维持实验室标记岗位的王霸之位有举足轻重的作用，实践出真知，真知出权威。

如此，只要是在每次标记的过程中出现诡异事件，江湖的朋友会不约而同的翘首以盼且众望所归于你身上，希望你重出江湖，一剑定乾坤！当然也少不了收获你助手小妹妹那崇拜的眼光！